Interaction lumière-matière : absorption, fluorescence et luminescence

La lumière visible et ultraviolette n'ionise pas les molécules mais les excite : elle est absorbée, puis restituée sous forme de chaleur ou de photons. Ce chapitre présente la loi de Beer-Lambert qui fonde la spectrophotométrie, le diagramme de Jablonski qui explique fluorescence et phosphorescence, et les applications de la fluorescence des molécules biologiques — un chapitre riche en définitions à connaître mot pour mot.

1. Absorption de la lumière et loi de Beer-Lambert

Une molécule absorbe un photon lorsque son énergie correspond exactement à l'écart entre deux niveaux électroniques : l'électron passe de l'état fondamental S₀ à un état excité S₁ (transitions π → π* ou n → π*). Pour un faisceau monochromatique traversant une cuve de trajet l contenant une solution de concentration C, l'intensité transmise I décroît exponentiellement. On définit la transmittance T = I/I₀ et l'absorbance A = log (I₀/I) = −log T. La loi de Beer-Lambert s'écrit A = ε × l × C, où ε est le coefficient d'extinction molaire (L·mol⁻¹·cm⁻¹), propre à la substance et à la longueur d'onde. Elle n'est valable que pour des solutions diluées (A inférieure à environ 1) et en lumière monochromatique. Le spectrophotomètre permet ainsi de doser une substance ou de suivre une réaction enzymatique : les protéines absorbent à 280 nm (tryptophane, tyrosine), les acides nucléiques à 260 nm, et le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ renseigne sur la pureté d'une préparation d'ADN (proche de 1,8 pour un ADN pur).

2. Chromophores, auxochromes et effets d'environnement

Un chromophore est le groupement responsable de l'absorption : doubles liaisons C=C, C=O, cycles aromatiques, noyau hème. Un auxochrome (–OH, –NH₂, –N(CH₃)₂, –Cl) ne colore pas par lui-même mais, lié à un chromophore, en augmente la délocalisation électronique et déplace le maximum d'absorption. La conjugaison rapproche les niveaux d'énergie : l'éthylène absorbe vers 165 nm, le buta-1,3-diène vers 217 nm, et plus la chaîne conjuguée s'allonge (caroténoïdes, rétinal), plus l'absorption glisse vers le visible. On parle d'effet bathochrome quand λ_max se déplace vers les grandes longueurs d'onde et d'effet hypsochrome dans le cas inverse ; d'effet hyperchrome ou hypochrome quand ε augmente ou diminue. Le solvant modifie lui aussi position et intensité des bandes, car il interagit différemment avec l'état fondamental et l'état excité. Exemple biologique de l'effet hypochrome : l'ADN double brin absorbe moins à 260 nm que l'ADN dénaturé, ce qui permet de suivre la fusion de la double hélice.

3. Diagramme de Jablonski : fluorescence et phosphorescence

Le diagramme de Jablonski représente les niveaux électroniques (S₀, S₁, T₁) et leurs sous-niveaux vibrationnels. Après l'absorption (quasi instantanée, 10⁻¹⁵ s), la molécule excitée perd d'abord de l'énergie sans émettre de lumière par relaxation vibrationnelle et conversion interne, jusqu'au niveau vibrationnel le plus bas de S₁. Elle peut alors revenir à S₀ en émettant un photon : c'est la fluorescence, transition entre deux états de même multiplicité (singulet → singulet), de durée de vie 10⁻¹⁰ à 10⁻⁷ s. Elle peut aussi basculer par conversion intersystème vers l'état triplet T₁, où l'électron excité a un spin parallèle à celui de son partenaire ; le retour T₁ → S₀, interdit par les règles de spin, est lent : c'est la phosphorescence, qui persiste de 10⁻⁶ s à plusieurs heures après l'arrêt de l'excitation (aiguilles de montre lumineuses). Dans un état singulet, les deux électrons ont des spins opposés et appariés ; dans un état triplet, parallèles (principe de Pauli).

4. Propriétés de la fluorescence

Comme une partie de l'énergie est dissipée avant l'émission, le photon émis est moins énergétique que le photon absorbé : la longueur d'onde d'émission est toujours plus grande que celle d'absorption. C'est le déplacement de Stokes, qui permet de séparer par un filtre la lumière de fluorescence de la lumière excitatrice. Le spectre d'émission a souvent une forme en miroir du spectre d'absorption et ne dépend pas de la longueur d'onde d'excitation (règle de Kasha). Le rendement quantique Φ, rapport du nombre de photons émis au nombre de photons absorbés, est compris entre 0 et 1. La fluorescence est très sensible à l'environnement : elle est réduite par l'extinction (quenching) par l'oxygène, les ions iodure ou l'acrylamide, par la température et par les collisions, et elle peut être transférée à une molécule voisine par FRET (transfert d'énergie par résonance), efficace seulement en dessous d'une dizaine de nanomètres — une véritable règle moléculaire.

5. Fluorescence intrinsèque et fluorescence externe

Certaines molécules biologiques sont naturellement fluorescentes (fluorescence intrinsèque) : le tryptophane (excitation vers 280 nm, émission vers 350 nm), plus faiblement la tyrosine et la phénylalanine, ce qui permet d'étudier le repliement et les changements de conformation des protéines ; le NADH (excitation vers 340 nm, émission vers 460 nm) et les flavines (FAD), utilisés pour suivre le métabolisme cellulaire ; la chlorophylle, qui émet dans le rouge. Quand la molécule d'intérêt n'est pas fluorescente, on lui greffe une sonde (fluorescence externe ou extrinsèque) : fluorescéine, rhodamine, DAPI qui se lie à l'ADN, ANS sensible aux zones hydrophobes, ou la protéine fluorescente verte GFP exprimée génétiquement. Ces outils fondent la fluorimétrie, la microscopie à fluorescence et confocale, la cytométrie en flux et les tests immunologiques par immunofluorescence. Selon le mode d'excitation, la luminescence prend d'autres noms : chimiluminescence (réaction chimique, luminol), bioluminescence (luciférase de la luciole), électroluminescence ou thermoluminescence.