Le clonage moléculaire repose sur deux outils : des ciseaux moléculaires, les enzymes de restriction, et des transporteurs, les vecteurs. Ce chapitre explique comment on coupe un ADN de façon reproductible, comment on l'insère dans un plasmide et comment on sélectionne les bactéries qui ont reçu la construction. C'est le chapitre le plus « appliqué » du module et celui qui fournit le plus d'exercices de TD.
1. Le système de restriction-modification
Les bactéries se défendent contre l'ADN étranger, notamment celui des bactériophages, grâce à un couple d'enzymes : une endonucléase de restriction qui coupe l'ADN au niveau de courtes séquences précises, et une méthylase qui modifie ces mêmes séquences sur l'ADN de la bactérie. L'ADN de l'hôte, méthylé, est protégé ; l'ADN étranger, non méthylé, est fragmenté. La nomenclature reflète l'origine bactérienne : dans EcoRI, E désigne le genre Escherichia, co l'espèce coli, R la souche RY13 et le chiffre romain l'ordre de découverte dans cette souche.
On distingue plusieurs types d'enzymes de restriction. Les enzymes de type I et de type III portent à la fois l'activité de coupure et de méthylation, exigent de l'ATP et coupent à distance variable de leur site de reconnaissance : elles sont donc inutilisables pour le clonage. Seules les enzymes de type II intéressent le généticien moléculaire : elles reconnaissent une séquence courte et coupent à l'intérieur ou immédiatement à côté de cette séquence, de façon parfaitement reproductible, en présence du seul cofacteur Mg2+.
2. Les enzymes de type II : sites palindromiques et types de coupure
Le site de reconnaissance des enzymes de type II compte le plus souvent 4 à 8 paires de bases et constitue un palindrome : la séquence lue 5'→3' est identique sur les deux brins. Ainsi EcoRI reconnaît GAATTC, dont le brin complémentaire lu 5'→3' est aussi GAATTC. La coupure peut être décalée, laissant des extrémités simple brin complémentaires appelées bouts cohésifs ou collants — EcoRI coupe entre G et A et libère des extrémités 5' protubérantes AATT ; ou franche, au centre du palindrome, laissant des bouts francs, comme SmaI qui coupe CCC/GGG.
Les bouts cohésifs sont précieux : deux fragments coupés par la même enzyme, même issus d'organismes différents, s'apparient spontanément par complémentarité avant d'être soudés. On parle alors d'enzymes isocaudomères lorsque deux enzymes de sites différents génèrent des extrémités compatibles. Statistiquement, une enzyme à site de 4 pb coupe beaucoup plus souvent qu'une enzyme à site de 6 ou 8 pb, ce qui permet de choisir la taille moyenne des fragments obtenus. La digestion d'un ADN suivie d'une électrophorèse fournit une carte de restriction : à partir des tailles des fragments obtenus par digestions simples et doubles, on reconstitue la position relative des sites, exercice de TD très fréquent.
Endonucléase bactérienne qui reconnaît une courte séquence palindromique et coupe l'ADN double brin à l'intérieur ou en bordure de ce site, de manière reproductible, en présence de Mg²⁺.
3. Les plasmides : caractéristiques et rôle de vecteur
Un plasmide est une molécule d'ADN double brin circulaire extrachromosomique, à réplication autonome grâce à sa propre origine (ori), présente en une à plusieurs dizaines de copies par bactérie. Sa taille varie de l'ordre du kilobase à quelques centaines de kilobases, et sa présence est facultative : il n'est pas indispensable à la survie, mais confère souvent un avantage — résistance à des antibiotiques ou à des métaux lourds, production de toxines ou de bactériocines. Les plasmides naturels les plus étudiés sont le facteur F responsable de la conjugaison, les plasmides R de résistance et les plasmides à colicines. Un épisome est un ADN circulaire capable, en plus, de s'intégrer au chromosome bactérien.
Un bon vecteur plasmidique doit être de petite taille (pour entrer facilement et se répliquer vite), posséder une origine de réplication fonctionnelle dans l'hôte, porter un marqueur de sélection phénotypique — le plus souvent un gène de résistance à un antibiotique — et offrir des sites de restriction uniques situés hors de l'origine et hors des gènes essentiels. Le pBR322, vecteur historique, porte deux gènes de résistance (ampicilline et tétracycline) et une vingtaine de sites uniques. Les vecteurs de la série pUC18/pUC19, de 2686 pb, concentrent une dizaine de sites uniques dans un site multiple de clonage (MCS) inséré dans le gène lacZ, et portent la résistance à l'ampicilline.
4. Les étapes du clonage et la ligation
Le clonage se déroule en quatre temps. On digère séparément l'ADN à cloner (l'insert) et le vecteur par la même enzyme, ou par deux enzymes différentes pour orienter l'insert. On ligature ensuite insert et vecteur grâce à l'ADN ligase du phage T4, qui reforme les liaisons phosphodiester en consommant de l'ATP ; le rapport molaire insert/vecteur est ajusté pour limiter la recircularisation du vecteur, souvent en déphosphorylant celui-ci à la phosphatase alcaline. On transforme enfin des bactéries compétentes (choc thermique après traitement au CaCl2, ou électroporation), puis on sélectionne les clones recombinants.
5. La sélection des clones recombinants
La première sélection est celle des bactéries transformées : on étale sur un milieu contenant l'antibiotique correspondant au marqueur du vecteur ; seules poussent les bactéries ayant reçu un plasmide. Reste à distinguer les plasmides recombinants (avec insert) des plasmides religaturés sur eux-mêmes. Avec pBR322, on utilisait l'inactivation insertionnelle : un insert placé dans le gène de résistance à la tétracycline rend le clone ampicilline-résistant mais tétracycline-sensible. Avec les vecteurs pUC, on utilise l'α-complémentation : un insert dans le MCS interrompt le gène lacZ, la β-galactosidase n'est plus fonctionnelle et la colonie reste blanche sur milieu X-Gal + IPTG, alors qu'un vecteur sans insert donne une colonie bleue.
6. Les autres vecteurs et le choix selon la taille de l'insert
Les plasmides n'acceptent que des inserts modestes, de l'ordre de quelques kilobases. Pour des fragments plus grands, on recourt aux vecteurs phagiques dérivés du bactériophage λ : les vecteurs de remplacement de la série EMBL comportent un bras gauche et un bras droit entre lesquels on insère un fragment étranger pouvant approcher 23 kb, le site BamHI étant le plus utilisé pour EMBL3 et EMBL4. Les cosmides combinent une origine plasmidique et les sites cos du phage λ ; les BAC (chromosomes artificiels bactériens, dérivés du facteur F) et les YAC (chromosomes artificiels de levure) acceptent respectivement des centaines de kilobases et jusqu'à un ordre de grandeur supérieur — ce sont les vecteurs des banques génomiques et des projets de séquençage.
| Vecteur | Nature | Capacité d'insertion | Hôte |
|---|---|---|---|
| Plasmide (pUC, pBR322) | ADN circulaire autonome | Quelques kb | Bactérie |
| Phage λ (EMBL) | Génome viral modifié | Jusqu'à ≈ 23 kb | Bactérie |
| Cosmide | Plasmide + sites cos | Quelques dizaines de kb | Bactérie |
| BAC | Dérivé du facteur F | Centaines de kb | Bactérie |
| YAC | Chromosome artificiel | Très grands fragments | Levure |
Choisir un vecteur selon la taille de l'insert
- Système restriction-modification : l'endonucléase coupe l'ADN étranger, la méthylase protège l'ADN de l'hôte.
- Seules les enzymes de type II servent au clonage : site palindromique de 4 à 8 pb, coupure reproductible, cofacteur Mg²⁺.
- Bouts cohésifs (EcoRI, GAATTC) vs bouts francs (SmaI, CCCGGG) ; les bouts cohésifs se religaturent plus facilement.
- Vecteur idéal : petite taille, ori fonctionnelle, marqueur de sélection, sites de restriction uniques dans un MCS.
- pUC18/19 = 2686 pb, MCS dans lacZ, résistance à l'ampicilline ; sélection blanc/bleu sur X-Gal + IPTG.
- La ligase T4 soude l'insert au vecteur ; la transformation se fait par choc thermique (CaCl₂) ou électroporation.
Attends-toi à un exercice de carte de restriction : on te donne les tailles des fragments après digestions simples puis double, tu dois placer les sites. Méthode : commence par vérifier que la somme des fragments égale la taille totale, et n'oublie pas qu'un ADN circulaire coupé une seule fois donne une seule bande linéaire. Le second grand classique est le test blanc/bleu : sache expliquer pourquoi une colonie blanche contient l'insert. Piège fréquent : oublier que la ligature peut recircler le vecteur vide, d'où la déphosphorylation.