Cinétique enzymatique : le modèle de Michaelis-Menten

La cinétique enzymatique décrit comment la vitesse d'une réaction catalysée varie avec la concentration en substrat, en enzyme et en effecteurs. Ce chapitre établit l'équation de Michaelis-Menten et explique les deux paramètres que tout étudiant de S4 doit savoir déterminer, V_max et K_m. C'est le chapitre des exercices : les calculs à partir d'un tableau de mesures ou d'une droite de Lineweaver-Burk tombent à chaque session.

1. Vitesse de réaction et vitesse initiale

La vitesse d'une réaction enzymatique est la quantité de produit formé (ou de substrat disparu) par unité de temps, exprimée en mol·L^-1·s^-1 ou en µmol·min^-1. Si l'on suit l'apparition du produit au cours du temps, la courbe présente trois phases : une très brève phase pré-stationnaire (formation du complexe ES, quelques millisecondes), une phase stationnaire où la concentration en ES reste constante et la vitesse maximale et linéaire, puis un ralentissement dû à l'épuisement du substrat, à l'accumulation du produit ou à la réaction inverse. Toutes les mesures se font sur la partie linéaire : c'est la vitesse initiale v₀, obtenue par la pente de la tangente à l'origine. À concentration de substrat saturante, v₀ est proportionnelle à la concentration d'enzyme : c'est le principe du dosage des enzymes en biochimie clinique (transaminases, phosphatases, LDH).

2. L'équation de Michaelis-Menten

Quand on mesure v₀ pour des concentrations croissantes de substrat, à concentration d'enzyme fixe, la courbe v₀ = f([S]) est une hyperbole : linéaire à faible [S] (cinétique d'ordre 1), elle s'infléchit puis tend vers un plateau, la vitesse maximale V_max, atteinte quand toute l'enzyme est saturée (ordre 0). Leonor Michaelis et Maud Menten (1913) puis Briggs et Haldane (1925) l'expliquent avec le schéma E + S ⇌ ES → E + P, avec les constantes k₁, k_-1 et k₂ (ou k_cat). En posant l'hypothèse de l'état stationnaire (la vitesse de formation de ES égale sa vitesse de disparition) et la conservation de l'enzyme ([E]_T = [E] + [ES]), on obtient :

v₀ = V_max · [S] / (K_m + [S]), avec V_max = k_cat · [E]_T et K_m = (k_-1 + k₂) / k₁. Trois cas limites à savoir retrouver : si [S] ≪ K_m, v₀ ≈ (V_max/K_m)·[S], la vitesse est proportionnelle au substrat ; si [S] = K_m, v₀ = V_max/2 ; si [S] ≫ K_m, v₀ ≈ V_max, l'enzyme est saturée. Ainsi, pour atteindre 90 % de V_max, il faut [S] = 9 K_m : le plateau n'est approché que très lentement, ce qui explique pourquoi on ne peut pas lire V_max précisément sur l'hyperbole.

3. Signification de Km, Vmax et kcat

K_m est une propriété de l'enzyme pour un substrat donné, indépendante de la concentration en enzyme : un K_m faible (micromolaire) signifie que l'enzyme est à demi saturée dès de très faibles concentrations, donc une forte affinité ; un K_m élevé traduit une faible affinité. Lorsque k₂ ≪ k_-1, K_m se confond avec la constante de dissociation K_S du complexe ES. Les valeurs de K_m sont en général proches des concentrations physiologiques du substrat, ce qui place l'enzyme dans la zone où sa vitesse répond aux variations de substrat : l'hexokinase (K_m glucose de l'ordre de 0,1 mM) est saturée dans le foie, alors que la glucokinase hépatique (K_m de l'ordre de 10 mM) n'accélère qu'après un repas riche en glucides. V_max, elle, dépend de la quantité d'enzyme : elle double si l'on double [E]_T.

La constante catalytique k_cat (ou nombre de renouvellement, turnover) est le nombre de molécules de substrat transformées par seconde et par site actif à saturation : k_cat = V_max/[E]_T. Elle va de quelques unités par seconde (lysozyme) à plusieurs centaines de milliers (anhydrase carbonique, catalase), les plus rapides des enzymes connues. Le rapport k_cat/K_m, appelé efficacité catalytique ou constante de spécificité, compare des enzymes ou des substrats entre eux ; sa limite supérieure, de l'ordre de 10⁸ à 10⁹ M^-1·s^-1, est celle de la diffusion : chaque rencontre enzyme-substrat aboutit alors à une réaction (enzymes « catalytiquement parfaites » comme la triose-phosphate isomérase).

4. Les représentations linéaires

Pour déterminer V_max et K_m avec précision, on linéarise l'hyperbole. La représentation en double inverse de Lineweaver et Burk trace 1/v₀ en fonction de 1/[S] : 1/v₀ = (K_m/V_max) · 1/[S] + 1/V_max. C'est une droite de pente K_m/V_max, d'ordonnée à l'origine 1/V_max et d'abscisse à l'origine −1/K_m. C'est la plus utilisée dans les cours et les examens, notamment pour identifier le type d'inhibition, mais elle écrase les points obtenus aux fortes concentrations et amplifie les erreurs aux faibles. La représentation d'Eadie-Hofstee (v₀ en fonction de v₀/[S], pente −K_m, ordonnée à l'origine V_max) et celle de Hanes-Woolf ([S]/v₀ en fonction de [S], pente 1/V_max) répartissent mieux l'erreur expérimentale.

5. Cinétique à deux substrats

La plupart des enzymes (transférases, oxydoréductases) agissent sur deux substrats. Dans les mécanismes séquentiels, les deux substrats se fixent avant que le premier produit ne soit libéré, formant un complexe ternaire : la fixation peut être ordonnée (le coenzyme NAD⁺ se fixe obligatoirement avant le substrat dans les déshydrogénases comme l'alcool déshydrogénase ou la malate déshydrogénase) ou aléatoire (créatine kinase, citrate synthase). Dans le mécanisme ping-pong, le premier substrat est transformé et son produit libéré avant que le second ne se fixe, l'enzyme passant par une forme modifiée : c'est le cas des aminotransférases (ALAT, ASAT) où le phosphate de pyridoxal porte transitoirement le groupement amine. Sur une représentation de Lineweaver-Burk à concentrations variables du second substrat, les mécanismes séquentiels donnent des droites qui se coupent, le ping-pong des droites parallèles.