Une protéine n'est fonctionnelle que repliée dans une conformation précise, dictée par sa séquence. Ce chapitre décrit les quatre niveaux de structure, les interactions qui les stabilisent, la dénaturation, puis les méthodes de séparation et de dosage utilisées au laboratoire. Les quatre niveaux structuraux et l'hélice α sont des questions de cours quasi certaines en Biochimie structurale S3.
1. La structure primaire
La structure primaire est la séquence linéaire des acides aminés, reliés par des liaisons peptidiques covalentes, écrite de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale. Elle est déterminée par la séquence du gène et contient toute l'information nécessaire au repliement (expérience d'Anfinsen sur la ribonucléase). Sa détermination classique combine la rupture des ponts disulfure (β-mercaptoéthanol, puis alkylation), l'hydrolyse en fragments par des agents spécifiques — trypsine (coupe après Lys et Arg), chymotrypsine (après Phe, Tyr, Trp), bromure de cyanogène (après Met) — et le séquençage de chaque fragment par la dégradation d'Edman ; les fragments de deux hydrolyses différentes sont ensuite superposés (peptides chevauchants). Aujourd'hui, la séquence est surtout déduite de l'ADN ou obtenue par spectrométrie de masse. Une seule substitution peut être dramatique : dans la drépanocytose, le remplacement d'un glutamate par une valine en position 6 de la chaîne β de l'hémoglobine provoque la falciformation des hématies.
2. La structure secondaire : hélice α et feuillet β
La structure secondaire désigne le repliement local et régulier du squelette peptidique, stabilisé uniquement par des liaisons hydrogène entre C=O et N–H de la chaîne principale. L'hélice α (Pauling et Corey, 1951) est une hélice droite comportant 3,6 résidus par tour, un pas de 0,54 nm et une élévation de 0,15 nm par résidu ; chaque C=O du résidu i est lié par liaison hydrogène au N–H du résidu i + 4, et les chaînes latérales pointent vers l'extérieur. La proline (pas de N–H, cycle rigide) et la glycine (trop flexible) rompent l'hélice ; l'hélice α est abondante dans la myoglobine et la kératine. Le feuillet β est formé de brins étendus, quasi plans, associés côte à côte par des liaisons hydrogène interbrins ; il est parallèle si les brins vont dans le même sens, antiparallèle sinon (le plus stable), avec les chaînes latérales alternativement au-dessus et au-dessous du plan. La fibroïne de la soie est presque entièrement en feuillets β. Les coudes β (4 résidus, souvent Gly ou Pro) inversent la direction de la chaîne, et les segments sans structure régulière forment des boucles. Les angles φ et ψ autorisés sont résumés par le diagramme de Ramachandran.
3. La structure tertiaire et les protéines fibreuses et globulaires
La structure tertiaire est le repliement tridimensionnel complet d'une chaîne polypeptidique, qui rapproche des résidus éloignés dans la séquence. Elle est stabilisée par des interactions faibles — effet hydrophobe (moteur principal : les résidus apolaires s'enfouissent au cœur, les polaires restent en surface), liaisons hydrogène, liaisons ioniques (ponts salins) et forces de Van der Waals — et par une liaison covalente, le pont disulfure entre deux cystéines, surtout dans les protéines extracellulaires. Les protéines fibreuses, insolubles, ont un rôle structural : le collagène (triple hélice de chaînes riches en Gly-X-Pro, hydroxyproline, résistance à la traction), les kératines (hélices α enroulées, cheveux, ongles), l'élastine. Les protéines globulaires, compactes et solubles, remplissent les fonctions dynamiques : enzymes, transporteurs (myoglobine, albumine), anticorps. Des régions compactes et autonomes du repliement, les domaines, sont souvent associées à une fonction (domaine de liaison à l'ATP, par exemple). Les chaperonnes assistent le repliement dans la cellule.
4. La structure quaternaire
Lorsqu'une protéine est formée de plusieurs chaînes polypeptidiques (sous-unités ou protomères), leur assemblage par des interactions non covalentes constitue la structure quaternaire. L'hémoglobine en est le modèle : tétramère α2β2, chaque sous-unité portant un hème, elle fixe l'oxygène de façon coopérative — la fixation sur une sous-unité facilite la fixation sur les autres, d'où sa courbe de saturation sigmoïde, alors que la myoglobine monomérique a une courbe hyperbolique. Ce comportement, l'allostérie, permet la régulation par des effecteurs (2,3-bisphosphoglycérate, protons, CO2). Les enzymes oligomériques, les immunoglobulines (2 chaînes lourdes + 2 chaînes légères) et les capsides virales illustrent aussi ce niveau d'organisation.
5. Propriétés physico-chimiques et dénaturation
Comme les acides aminés, une protéine est un polyampholyte dont la charge dépend du pH : à son pHi, sa charge nette est nulle et sa solubilité minimale, ce qui permet de la précipiter. La solubilité dépend aussi de la force ionique : une faible concentration en sel la favorise (salting in), une forte concentration en sulfate d'ammonium la précipite (salting out) en captant l'eau de solvatation. La dénaturation est la perte des structures secondaire, tertiaire et quaternaire sans rupture des liaisons peptidiques : la structure primaire est conservée mais la fonction est perdue. Agents dénaturants : la chaleur, les pH extrêmes, l'urée et le chlorure de guanidinium (rompent les liaisons hydrogène), les détergents comme le SDS, les solvants organiques, les métaux lourds, et les agents réducteurs (β-mercaptoéthanol, DTT) qui coupent les ponts disulfure. Anfinsen a montré que la ribonucléase dénaturée par l'urée et le β-mercaptoéthanol se renature spontanément après élimination des agents, preuve que la séquence dicte la conformation.
6. Méthodes de séparation et de dosage des protéines
La purification enchaîne plusieurs étapes. La précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium (exprimée en pourcentage de saturation), aux solvants organiques froids ou au pHi concentre l'échantillon ; la dialyse élimine ensuite les petites molécules à travers une membrane semi-perméable. Les chromatographies exploitent chacune une propriété : la gel filtration (exclusion) sépare selon la taille, les grosses molécules sortant les premières ; l'échange d'ions sépare selon la charge (résine anionique DEAE, cationique CM) ; l'affinité retient la protéine par un ligand spécifique (substrat, anticorps, nickel pour les étiquettes histidine) et donne la meilleure purification. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) dénature les protéines et les sépare uniquement selon leur masse ; la focalisation isoélectrique les sépare selon leur pHi dans un gradient de pH. Le dosage utilise l'absorbance à 280 nm (Trp, Tyr), la réaction du biuret (liaisons peptidiques, complexe violet avec Cu2+), la méthode de Lowry ou celle de Bradford (bleu de Coomassie).
Perte de la conformation native (structures secondaire, tertiaire, quaternaire) d'une protéine sous l'effet de la chaleur, du pH, de l'urée ou des détergents, sans hydrolyse des liaisons peptidiques ; elle entraîne la perte de fonction.
| Niveau | Description | Liaisons impliquées | Exemple |
|---|---|---|---|
| Primaire | Séquence des acides aminés | Peptidiques (covalentes) | Insuline : 51 résidus |
| Secondaire | Hélice α, feuillet β, coudes | Hydrogène (squelette) | Kératine, fibroïne |
| Tertiaire | Repliement 3D d'une chaîne | Hydrophobes, H, ioniques, S–S | Myoglobine |
| Quaternaire | Association de sous-unités | Non covalentes | Hémoglobine α₂β₂ |
Les quatre niveaux de structure des protéines
- Primaire = séquence (covalente) ; secondaire = hélice α (3,6 résidus/tour, pas 0,54 nm, H i→i+4) et feuillet β (parallèle/antiparallèle).
- Tertiaire stabilisée par l'effet hydrophobe, liaisons H, ponts salins, Van der Waals et ponts disulfure ; fibreuses (collagène, kératine) vs globulaires (enzymes).
- Quaternaire = plusieurs sous-unités ; hémoglobine α₂β₂ coopérative (sigmoïde) vs myoglobine (hyperbolique).
- Dénaturation (chaleur, pH, urée, SDS, β-mercaptoéthanol) conserve la structure primaire ; Anfinsen : la séquence dicte le repliement.
- Purification : salting out → dialyse → chromatographies (taille, charge, affinité) → SDS-PAGE (masse) ; dosage Biuret, Bradford, A280.
Question de cours classique : décrire les quatre niveaux de structure avec les liaisons qui les stabilisent, ou détailler l'hélice α (chiffres à connaître). Les exercices portent sur l'interprétation d'un SDS-PAGE ou d'une gel filtration, et sur le choix d'une méthode de purification. Piège : écrire que la dénaturation rompt les liaisons peptidiques, ou confondre trypsine (Lys, Arg) et chymotrypsine (aromatiques).