Les ARN, propriétés physico-chimiques et méthodes d'étude des acides nucléiques

Après l'ADN, ce chapitre présente les différentes classes d'ARN et leurs structures, puis les propriétés physico-chimiques des acides nucléiques (absorption UV, dénaturation thermique, hybridation) qui fondent toutes les techniques du laboratoire : enzymes de restriction, électrophorèse, Southern blot, PCR et séquençage. Le tableau ADN/ARN et le principe de la PCR sont des questions attendues en Biochimie structurale S3.

1. Les différents types d'ARN et leurs structures

L'ARN diffère de l'ADN par son sucre (ribose, avec un OH en 2'), par l'uracile qui remplace la thymine, et par son caractère généralement monocaténaire : un simple brin qui se replie sur lui-même en formant des régions bicaténaires locales — tiges, épingles à cheveux, boucles, renflements — par appariements A-U et G-C, ainsi que des appariements non canoniques comme G-U. Sa masse moléculaire est plus variable et généralement plus faible que celle de l'ADN. L'ARN messager (ARNm), copie d'un gène, porte la séquence codante sous forme de codons de trois nucléotides ; chez les eucaryotes il est mûri par ajout d'une coiffe de 7-méthylguanosine en 5', d'une queue poly(A) en 3' et par épissage des introns. L'ARN de transfert (ARNt, 73 à 93 nucléotides) adopte une structure secondaire en feuille de trèfle à quatre bras — bras accepteur terminé par la séquence CCA-3' où se fixe l'acide aminé, bras D, bras de l'anticodon, bras TΨC — repliée en L dans l'espace ; il contient de nombreuses bases modifiées (pseudouridine Ψ, dihydrouridine, inosine). L'ARN ribosomique (ARNr) est le plus abondant (environ 80 % de l'ARN cellulaire) et constitue avec des protéines les ribosomes : 70S chez les procaryotes (sous-unités 50S et 30S, ARNr 23S, 5S et 16S), 80S chez les eucaryotes (60S et 40S, ARNr 28S, 5,8S, 5S et 18S). S'y ajoutent les petits ARN nucléaires de l'épissage, les microARN régulateurs et, chez les eucaryotes, trois ARN polymérases spécialisées : I (grands ARNr), II (ARNm), III (ARNt et ARNr 5S).

2. Propriétés physico-chimiques : absorption UV, dénaturation, hybridation

Les bases absorbent l'ultraviolet avec un maximum à 260 nm, ce qui permet de doser les acides nucléiques : une unité d'absorbance à 260 nm correspond à environ 50 µg/mL d'ADN double brin (40 µg/mL d'ARN), et le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ voisin de 1,8 pour l'ADN (2,0 pour l'ARN) signale une préparation pure, sans protéines. Chauffé, l'ADN double brin se sépare en deux brins : c'est la dénaturation thermique, accompagnée d'une hausse de l'absorbance d'environ 40 % (effet hyperchrome) car les bases empilées absorbaient moins. La température à laquelle la moitié de l'ADN est dénaturée est la température de fusion T_m ; elle augmente avec le pourcentage de G+C (trois liaisons hydrogène et meilleur empilement), avec la force ionique (les cations masquent la répulsion des phosphates) et avec la longueur du fragment, et diminue en présence d'urée ou de formamide. En refroidissant lentement, les brins complémentaires se réassocient : c'est la renaturation, et lorsque les deux brins proviennent de molécules différentes (ADN-ADN, ADN-ARN), on parle d'hybridation, principe des sondes et des puces. Enfin, l'ARN est hydrolysé par les bases fortes (NaOH) grâce à son OH 2' qui attaque le phosphate voisin, alors que l'ADN y résiste ; les deux sont dépurinés par les acides. La densité de flottaison en gradient de chlorure de césium augmente avec le contenu en G+C et permet de séparer ADN et ARN.

3. Les enzymes outils : nucléases, polymérases, ligases

Les nucléases hydrolysent les liaisons phosphodiester : les exonucléases à partir d'une extrémité, les endonucléases à l'intérieur de la chaîne. Les enzymes de restriction bactériennes (EcoRI, BamHI, HindIII…) sont des endonucléases qui reconnaissent une courte séquence palindromique de 4 à 8 pb — EcoRI coupe GAATTC — et produisent soit des bouts francs, soit des bouts cohésifs décalés, qui permettent de recombiner des fragments d'origines différentes ; le nombre de sites détermine le nombre de fragments (carte de restriction). Les ADN polymérases synthétisent un brin complémentaire de 5' vers 3' à partir d'une matrice et d'une amorce portant un OH 3' libre, en utilisant les désoxynucléosides triphosphates ; la Taq polymérase de Thermus aquaticus résiste à la chaleur. L'ADN ligase ressoude deux fragments en formant une liaison phosphodiester (ATP). La transcriptase inverse des rétrovirus copie un ARN en ADN complémentaire (ADNc) et les ARN polymérases transcrivent l'ADN en ARN sans amorce.

4. Électrophorèse, Southern blot, PCR et séquençage

L'électrophorèse sur gel d'agarose (ou de polyacrylamide pour les petits fragments) sépare les acides nucléiques, tous chargés négativement, uniquement selon leur taille : les petits fragments migrent le plus vite vers l'anode ; la révélation se fait au bromure d'éthidium sous UV, avec un marqueur de taille. Dans le Southern blot, l'ADN digéré et séparé est dénaturé, transféré sur une membrane de nylon et hybridé avec une sonde marquée (radioactive ou fluorescente) complémentaire de la séquence recherchée ; le Northern blot applique le même principe aux ARN, le Western blot aux protéines avec des anticorps. La PCR (réaction de polymérisation en chaîne, Mullis, 1985) amplifie in vitro un fragment d'ADN encadré par deux amorces : chaque cycle comprend une dénaturation à 94–95 °C, une hybridation des amorces à 50–65 °C (selon leur T_m) et une élongation à 72 °C par la Taq polymérase ; après n cycles, on obtient théoriquement 2ⁿ copies, soit environ un million après 20 cycles. La RT-PCR ajoute une étape de transcription inverse pour amplifier un ARN, et la PCR quantitative en temps réel mesure l'amplification par fluorescence. Le séquençage de Sanger (méthode des didésoxynucléotides) utilise une polymérase, une amorce, les quatre dNTP et une faible proportion de ddNTP dépourvus d'OH 3' qui arrêtent la synthèse à chaque incorporation ; les fragments de toutes les tailles sont séparés par électrophorèse et la séquence lue par la couleur ou la piste terminale de chaque fragment.

5. Réplication semi-conservative et flux de l'information génétique

Avant chaque division, l'ADN est dupliqué par réplication. Elle est semi-conservative : chaque molécule fille contient un brin parental et un brin néosynthétisé, comme l'ont prouvé Meselson et Stahl en 1958 en suivant, par gradient de chlorure de césium, un ADN marqué à l'azote lourd ¹⁵N transféré en milieu ¹⁴N. À partir d'une origine de réplication (unique chez les bactéries, multiples chez les eucaryotes), l'hélicase ouvre un œil de réplication bidirectionnel ; chaque brin sert de matrice et l'ADN polymérase ajoute les nucléotides complémentaires dans le sens 5'→3', de façon continue sur le brin direct et par fragments d'Okazaki sur le brin retardé, après amorçage par une primase, puis la ligase soude les fragments. Le flux de l'information génétique (dogme central) va de l'ADN à l'ARN par la transcription, puis de l'ARN aux protéines par la traduction sur le ribosome, suivant le code génétique : 64 codons, dont 61 codent les 20 acides aminés (code dégénéré) et 3 codons stop (UAA, UAG, UGA), le codon initiateur AUG spécifiant la méthionine ; le code est universel et non chevauchant. Le concept « un gène – un polypeptide » (Beadle et Tatum) et l'exemple de la drépanocytose (Ingram) illustrent le lien entre séquence nucléotidique et séquence protéique.