Solubilité et précipitation des protéines

La précipitation est la première étape de la plupart des purifications de protéines : elle concentre l'extrait et élimine une partie de la matrice à faible coût. Ce chapitre explique de quoi dépend la solubilité d'une protéine, puis les quatre leviers pour la faire précipiter : pH, sels, solvants organiques et polymères. Le commentaire de courbes solubilité = f(pH, force ionique) est l'exercice roi de ce module.

1. Pourquoi purifier et comment stabiliser une protéine

On purifie une protéine pour étudier ses propriétés, déterminer sa séquence ou sa structure tridimensionnelle, ou la produire (enzymes industrielles, protéines recombinantes thérapeutiques). La difficulté est que la cellule contient plus d'un millier de protéines différentes, chacune représentant en moyenne moins d'un millième du total ; la solution est d'exploiter leurs différences de propriétés : solubilité, taille, point isoélectrique, charge, hydrophobicité, affinité pour un ligand. Pendant toute la purification, on préserve l'intégrité de la protéine : tampons maintenant le pH dans une zone physiologique (7,5 à 8), température de 0 à 5 °C (beaucoup de protéines se dénaturent lentement dès 25 °C), conservation à long terme entre −20 et −80 °C, et inhibiteurs de protéases (EDTA, PMSF) contre les enzymes libérées à la lyse.

2. Les facteurs de la solubilité

Une protéine globulaire native replie ses chaînes latérales hydrophobes vers l'intérieur et expose en surface une mosaïque de plages polaires, ioniques et de quelques plages apolaires. Sa solubilité en milieu aqueux dépend de trois phénomènes qui s'additionnent. L'hydratation : les molécules d'eau forment autour de la protéine une coque d'hydratation qui l'empêche de s'agréger ; tout agent déshydratant (sel à forte concentration, PEG, solvant organique) la déstabilise. La charge électrostatique : les protéines de même charge se repoussent, tandis qu'une protéine neutre n'est plus protégée par cette répulsion. La conformation : la dénaturation expose les groupements hydrophobes, qui s'agrègent entre eux et avec ceux des autres protéines dénaturées, d'où une chute brutale de solubilité. Ces interactions dépendent de la température, du pH, de la force ionique et de la constante diélectrique du milieu.

3. L'influence du pH : précipitation isoélectrique

Les protéines sont des polyélectrolytes amphotères : les chaînes latérales ionisables (Asp, Glu, Lys, Arg, His) et les extrémités N et C-terminales leur confèrent une charge nette qui dépend du pH. À pH acide, la forme P⁺ domine ; à pH basique, la forme P⁻. Au pH isoélectrique (pHi), la protéine porte autant de charges positives que négatives : charge nette nulle, répulsion électrostatique minimale, les attractions locales l'emportent, les molécules s'agrègent en réseau et précipitent. La courbe solubilité = f(pH) passe donc par un minimum au pHi et remonte de part et d'autre. Comme chaque protéine a son propre pHi, on peut précipiter sélectivement une protéine d'un mélange en amenant le pH à son pHi : c'est la précipitation isoélectrique, utilisée par exemple pour la caséine du lait (pHi ≈ 4,6). Dans un mélange, les interactions entre protéines de pHi différents compliquent le tableau, et l'ajout d'un sel améliore la spécificité.

4. L'influence des sels : salting-in et salting-out

À faible force ionique, les ions d'un sel se fixent à la surface de la protéine, forment des ponts salins avec l'eau et renforcent la coque d'hydratation : la solubilité augmente, c'est le salting-in (les courbes solubilité = f(pH) tracées à des concentrations croissantes de NaCl sont décalées vers le haut, quasi parallèles). À forte concentration, les ions monopolisent les molécules d'eau : la protéine est déshydratée, ses plages hydrophobes s'exposent et elle précipite, c'est le salting-out. Le sel de référence est le sulfate d'ammonium (NH₄)₂SO₄ : très soluble (saturation voisine de 4 mol/L à température ambiante), peu coûteux, non dénaturant et stabilisant. Chaque protéine précipitant à un pourcentage de saturation différent, on réalise un fractionnement par paliers (par exemple 0 à 40 % puis 40 à 70 % de saturation), et la précipitation est réversible : le culot redissous est dessalé par dialyse. L'efficacité des ions suit la série de Hofmeister (SO₄²⁻ plus efficace que Cl⁻).

5. Solvants organiques, polymères et polyélectrolytes

Les solvants miscibles à l'eau (méthanol, éthanol, acétone, butanol) possèdent une région polaire et une région hydrophobe : ils entrent en compétition avec l'eau pour les groupements polaires de la protéine, abaissent la constante diélectrique (renforçant les attractions électrostatiques) et diminuent l'hydratation. Plus la protéine est grosse, plus la concentration de solvant nécessaire est faible ; plus la chaîne aliphatique de l'alcool est longue, plus il précipite efficacement. Deux inconvénients : les grands volumes requis (environ deux volumes d'acétone, quatre volumes d'éthanol) et le risque de dénaturation, que l'on limite en travaillant à température négative (autour de −10 à −20 °C). Le fractionnement de Cohn du plasma humain par l'éthanol à froid, qui isole l'albumine et les immunoglobulines, en est l'application historique. Le polyéthylène glycol (PEG), polymère neutre, précipite par exclusion de volume et déshydratation, en douceur et sans chauffer. Les polyélectrolytes (polymères chargés) forment des réseaux avec les protéines de charge opposée à très faible concentration (0,05 à 0,10 % m/v).

6. Précipitation dénaturante ou non, et suite du protocole

La précipitation a deux objectifs opposés. Si l'on veut éliminer les protéines d'un échantillon (déprotéinisation avant dosage d'un métabolite ou extraction d'acides nucléiques) ou seulement doser les protéines totales, on peut les dénaturer irréversiblement : acide trichloracétique (TCA), acide perchlorique, chaleur, acétone froide ; le précipité inactif est écarté par centrifugation. Si l'on veut récupérer une protéine active, le procédé doit être réversible et conserver la structure native : précipitation isoélectrique douce, sulfate d'ammonium, PEG, éthanol à froid. Dans tous les cas, la précipitation est un transfert d'un soluté de la phase liquide vers une phase solide qui apparaît progressivement, comme une extraction dont la phase réceptrice serait virtuelle au départ. Le culot est ensuite redissous dans un petit volume de tampon, puis dessalé par dialyse (membrane semi-perméable retenant les macromolécules) ou par gel filtration avant les chromatographies.