Après les principes généraux, ce dernier chapitre passe en revue les chromatographies réellement utilisées pour purifier les protéines et les acides nucléiques, l'instrumentation HPLC, puis l'électrophorèse, technique complémentaire fondée sur la migration dans un champ électrique. Savoir associer chaque technique à la propriété exploitée et proposer un enchaînement de purification est l'objectif final du module.
1. Chromatographie d'exclusion (gel filtration)
La phase stationnaire est un gel de billes poreuses (Sephadex à base de dextrane, Sepharose à base d'agarose, Bio-Gel à base de polyacrylamide) dont la porosité est calibrée. Les grosses molécules, exclues des pores, ne parcourent que le volume interstitiel et sortent en premier au volume mort V0 ; les petites molécules pénètrent dans les pores, parcourent un chemin plus long et sortent plus tard, jusqu'au volume total Vt. Entre les deux, le volume d'élution Ve d'une protéine est une fonction linéaire du logarithme de sa masse molaire, ce qui permet de déterminer la masse molaire native d'une protéine par comparaison avec des standards. Aucune interaction n'étant mise en jeu, la technique est très douce ; elle sert aussi au dessalage et au changement de tampon (les sels sortent bien après les protéines). Sa limite est une faible capacité, d'où son emploi en fin de purification.
2. Chromatographie d'échange d'ions
La phase stationnaire est une résine ou un gel porteur de groupements chargés. Un échangeur d'anions porte des charges positives (DEAE-cellulose, diéthylaminoéthyl, échangeur faible ; Q, ammonium quaternaire, échangeur fort) et fixe les protéines chargées négativement, c'est-à-dire à un pH supérieur à leur pHi. Un échangeur de cations porte des charges négatives (CM-cellulose, carboxyméthyl ; S, sulfonate) et fixe les protéines à un pH inférieur à leur pHi. Les protéines de charge opposée ou nulle ne sont pas retenues. L'élution se fait par gradient croissant de sel (NaCl, dont les ions déplacent les protéines par compétition, les moins chargées sortant les premières) ou par changement de pH qui annule la charge de la protéine. Capacité élevée et bon pouvoir résolutif en font l'étape centrale de la plupart des purifications ; les résines échangeuses servent aussi à l'analyse des acides aminés et à la déminéralisation de l'eau.
3. Interactions hydrophobes et phase inverse
La chromatographie d'interactions hydrophobes (HIC) sépare les protéines natives selon leur hydrophobicité de surface : à forte concentration en sel (souvent après une précipitation au sulfate d'ammonium), les plages hydrophobes exposées se lient à un gel porteur de groupements phényle ou octyle. L'élution s'obtient en diminuant la concentration en sel ou en ajoutant un solvant moins polaire que l'eau (éthylène glycol). La chromatographie en phase inverse repose sur le même type d'interaction mais sur silice greffée C8 ou C18 avec des éluants organiques (acétonitrile, méthanol) en gradient croissant : très résolutive, elle dénature généralement les protéines et est réservée aux peptides, aux petites molécules et à l'analyse.
4. Chromatographie d'affinité
C'est la technique la plus sélective : un ligand reconnu spécifiquement par la protéine cible est greffé de façon covalente sur un support inerte (agarose activé au bromure de cyanogène), souvent par l'intermédiaire d'un bras espaceur. Seule la protéine d'intérêt se fixe ; la matrice est lavée puis la protéine est éluée par un compétiteur (ligand libre en excès) ou par modification du pH ou de la force ionique. Exemples : substrat ou inhibiteur pour une enzyme, anticorps pour un antigène (immunoaffinité), protéine A pour les immunoglobulines G, lectines (concanavaline A) pour les glycoprotéines, et chromatographie sur ions métalliques immobilisés (IMAC) : une colonne de nickel chélaté (Ni-NTA) retient les protéines recombinantes munies d'une étiquette polyhistidine, éluées par l'imidazole. Une seule étape peut alors apporter un facteur de purification de plusieurs centaines.
5. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
L'HPLC est une chromatographie sur colonne dans laquelle la phase stationnaire est constituée de particules très fines et uniformes (typiquement 3 à 5 μm), ce qui exige une pompe à haute pression (jusqu'à plusieurs centaines de bars) pour faire circuler l'éluant. La chaîne comprend le réservoir de solvants et le dégazeur, la pompe (isocratique ou à gradient), l'injecteur à boucle, la colonne thermostatée (souvent précédée d'une précolonne de protection), le détecteur (UV-visible, à barrette de diodes, fluorimétrique, réfractométrique, ou spectromètre de masse en LC-MS) et le système d'acquisition. Les colonnes peuvent fonctionner en adsorption, phase inverse (la plus répandue), échange d'ions, exclusion ou affinité. L'HPLC apporte rapidité, reproductibilité, grande efficacité (N de plusieurs milliers de plateaux) et sensibilité, et permet le dosage de vitamines, acides aminés, sucres, médicaments ou peptides dans les matrices biologiques.
6. L'électrophorèse
L'électrophorèse sépare des solutés chargés par migration dans un champ électrique : les anions vers l'anode, les cations vers la cathode, à une vitesse proportionnelle à leur charge et inversement liée à leur taille et à la résistance du support (papier, acétate de cellulose, gel d'agarose pour les acides nucléiques, gel de polyacrylamide plus ou moins réticulé pour les protéines). En électrophorèse native (PAGE), la migration dépend à la fois de la charge, de la taille et de la forme de la protéine, qui reste active. En SDS-PAGE (Laemmli), les protéines sont dénaturées par chauffage en présence de SDS, détergent anionique qui se fixe uniformément sur la chaîne et masque sa charge propre, et d'un réducteur (β-mercaptoéthanol ou DTT) qui rompt les ponts disulfure ; toutes les chaînes ont alors la même densité de charge et migrent uniquement selon leur taille à travers le tamis du gel : la distance de migration est une fonction linéaire du logarithme de la masse molaire, ce qui permet d'estimer la masse d'une sous-unité par rapport à des marqueurs. En focalisation isoélectrique (IEF), un gradient de pH établi par des ampholytes fait migrer chaque protéine jusqu'au pH égal à son pHi, où sa charge nulle l'immobilise. L'électrophorèse bidimensionnelle combine IEF puis SDS-PAGE et résout des milliers de protéines. Les bandes sont révélées au bleu de Coomassie, au nitrate d'argent, ou transférées sur membrane pour un western blot.
En gel filtration, volume d'éluant nécessaire pour faire sortir les molécules totalement exclues des pores ; les molécules plus petites sont éluées entre V0 et le volume total Vt.
Électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium : les protéines dénaturées, chargées uniformément par le SDS, sont séparées selon leur seule masse molaire.
| Technique | Propriété exploitée | Ordre de sortie ou élution | Point fort |
|---|---|---|---|
| Gel filtration | Taille (masse native) | Grosses molécules d'abord | Douce, dessalage, masse native |
| Échange d'ions | Charge nette (pH vs pHi) | Gradient de sel ou de pH | Grande capacité |
| Interactions hydrophobes | Hydrophobicité de surface | Sel décroissant | Après salting-out |
| Affinité | Reconnaissance d'un ligand | Compétiteur, pH | Sélectivité maximale |
| SDS-PAGE | Masse des sous-unités | Petites chaînes migrent le plus loin | Contrôle de pureté, masse |
| Focalisation isoélectrique | pHi | Arrêt au pH = pHi | Résolution de 0,01 unité pH |
Choisir une technique selon la propriété de la protéine
- Gel filtration : les grosses molécules sortent en premier (V0), les petites en dernier ; Ve varie linéairement avec log de la masse molaire.
- Échange d'anions (DEAE, Q) fixe les protéines à pH > pHi ; échange de cations (CM, S) à pH < pHi ; élution par gradient de sel ou de pH.
- Affinité : ligand greffé, élution par compétiteur ; IMAC Ni-NTA pour les protéines à étiquette polyhistidine.
- HPLC = particules de 3 à 5 μm, pompe haute pression, détecteur UV ; phase inverse C18 la plus répandue.
- Native PAGE : charge, taille et forme ; SDS-PAGE : taille seule (log MM linéaire) ; IEF : pHi ; 2D = IEF puis SDS-PAGE.
Le sujet de synthèse demande de proposer un protocole de purification d'une protéine dont on connaît le pHi et la masse (par exemple : précipitation au sulfate d'ammonium, dessalage, échange d'ions à un pH bien choisi, gel filtration, contrôle par SDS-PAGE) et de justifier chaque étape par la propriété exploitée. On te demandera aussi de prévoir si une protéine se fixe sur DEAE à un pH donné, ou d'estimer une masse molaire à partir d'un gel SDS-PAGE et de marqueurs. Piège classique : en gel filtration, ce sont les grosses molécules qui sortent en premier, l'inverse de l'intuition.