Fiche de révision · S3

Résumé — Techniques chimiques pour la biologie

Tout le module en une page : les chapitres condensés en points essentiels, le vocabulaire et les pièges d'examen. Pour la veille de l'épreuve.

Introduction : biosystèmes, analytes et propriétés physico-chimiques

Technique analytique = déterminer nature ou quantité d'un composant ; technique préparative = l'isoler en quantité ; différence d'échelle (mg vs g).
Biosystème = tout système de biomolécules (organisme, organe, tissu, cellule, fluide) ; analyte = molécule étudiée ; matrice = tout le reste, qui interfère avec la mesure.
Biomolécules classées par taille (petites molécules, monomères, polymères) ou par famille (protides, acides nucléiques, glucides, lipides).
Propriété intensive (densité, point de fusion) → identification vs propriété extensive (absorbance, loi de Beer-Lambert) → dosage.
Trois contraintes des biosystèmes : filiation chimique (précurseur/produit proches), faible concentration et fragilité, dynamique du métabolisme.

État de la matière = équilibre entre agitation thermique (disperse) et forces intermoléculaires (rassemblent) ; CO2 supercritique au-delà de 31 °C et 74 bar.
Forces intramoléculaires (liaisons chimiques, centaines de kJ/mol) vs forces intermoléculaires (charges partielles, quelques kJ/mol) → propriétés physiques.
Liaison polaire si électronégativités différentes (F le plus électronégatif) ; la polarité d'une molécule dépend aussi de sa géométrie (CO2 linéaire apolaire vs H2O coudée polaire).
Van der Waals = Keesom (dipôle-dipôle) + Debye (dipôle-dipôle induit) + London (dipôles instantanés, universelle) ; liaison hydrogène plus forte (10 à 40 kJ/mol).
Le semblable dissout le semblable ; constante diélectrique ε ≈ 80 pour l'eau (solvate les ions) vs ε ≈ 2 pour l'hexane (dissout les lipides).

Travailler vite, à froid (0 à 4 °C), en tampon, avec inhibiteurs de protéases : la lyse libère protéases, nucléases et phénoloxydases qui dégradent l'analyte.
Cellule animale sans paroi → broyage doux (Potter-Elvehjem) ; cellule végétale à paroi cellulosique → mortier, azote liquide + PVPP contre les phénols.
Microorganismes (paroi résistante) → sonication, presse de French, billes de verre, ou lysozyme (+ EDTA pour les Gram négatif).
Détergents non ioniques doux (Triton X-100) préservent les protéines ; SDS, détergent anionique fort, dénature tout (acides nucléiques, SDS-PAGE).
Tampon isotonique (saccharose 0,25 M) et pH 7,2 à 7,6 pour conserver les organites intacts en fractionnement subcellulaire.

Extraction = transfert d'un composé vers un solvant où il est plus soluble ; solvant idéal non miscible, sélectif, volatil.
Solide-liquide : macération (froid) vs infusion (versé chaud) vs décoction (ébullition) ; Soxhlet automatise en réutilisant du solvant pur.
Liquide-liquide : coefficient de partage K = Corg / Caq ; plusieurs petites extractions valent mieux qu'une grande pour un même volume total.
Hydrodistillation (plante dans l'eau bouillante) vs entraînement à la vapeur (vapeur produite à part) → huiles essentielles récupérées dans un Clevenger.
CO2 supercritique (31 °C, 74 bar) : solvant apolaire propre, extraits obtenus par simple dépressurisation ; SPE = conditionnement → dépôt → lavage → élution.

Loi de Stokes : v = 2 r² g (ρp − ρf) / 9 η → vitesse croît avec le carré du rayon, avec la différence de densité, diminue avec la viscosité.
RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × r(cm) × N²(rpm) : dépend du rayon du rotor, toujours exprimer un protocole en g plutôt qu'en rpm seul.
Coefficient de sédimentation en Svedberg (1 S = 10⁻¹³ s), non additif : 30S + 50S = 70S (procaryotes), 40S + 60S = 80S (eucaryotes).
Centrifugation différentielle : forces croissantes → noyaux (≈1000 g) → mitochondries/lysosomes (≈10-20 000 g) → microsomes (≈100 000 g) → cytosol.
Zonale (vitesse, arrêtée avant l'équilibre, séparation par taille/forme) vs isopycnique (densité, à l'équilibre, gradient de CsCl, Meselson et Stahl).

Solubilité = hydratation + répulsion électrostatique + conformation native ; tout agent qui les réduit (sel, PEG, solvant, dénaturation) fait précipiter.
Au pHi la charge nette est nulle, la solubilité minimale : précipitation isoélectrique sélective (caséine du lait, pHi ≈ 4,6).
Faible force ionique → salting-in (solubilité accrue) vs forte force ionique → salting-out (sulfate d'ammonium, saturation ≈ 4 mol/L, réversible).
Solvants organiques (éthanol, acétone) efficaces à froid mais volumineux et risque de dénaturation ; PEG plus doux (exclusion de volume).
Précipitation dénaturante (TCA, chaleur) pour éliminer/doser vs non dénaturante (sulfate d'ammonium, PEG) pour récupérer une protéine active ; dessalage par dialyse.

Chromatographie = migration différentielle entre phase stationnaire (retient) et phase mobile (entraîne) ; Tswett 1903, Martin et Synge Nobel 1952.
Classification par phase mobile (CPL, CPG, CFS), par support (planaire, colonne) et par mécanisme (adsorption, partage, échange d'ions, exclusion, affinité).
Sur silice (adsorption), le plus polaire est le plus retenu ; en phase inverse C18, c'est l'inverse ; Rf = distance soluté / distance front (CCM).
k = (tR − tM)/tM (1 à 10 idéal) ; α = k2/k1 (sélectivité) ; N = 16 (tR/w)² (efficacité) ; H = L/N (van Deemter : débit optimal).
Résolution Rs = 2 ΔtR / (w1 + w2), séparation complète si Rs ≥ 1,5 ; la sélectivité α est le levier le plus efficace pour l'améliorer.

Gel filtration : grosses molécules exclues sortent en premier (V0), petites en dernier (Vt) ; Ve linéaire avec log de la masse molaire → détermine la masse native.
Échange d'anions (DEAE, Q) fixe à pH > pHi ; échange de cations (CM, S) fixe à pH < pHi ; élution par gradient de sel ou de pH.
Affinité : ligand greffé + élution par compétiteur, sélectivité maximale ; IMAC Ni-NTA pour protéines à étiquette polyhistidine (élution imidazole).
HPLC : particules 3 à 5 μm, pompe haute pression, détecteur UV ; phase inverse C18 la plus répandue, plusieurs milliers de plateaux.
Native PAGE (charge + taille + forme) vs SDS-PAGE (taille seule, log MM linéaire) vs IEF (arrêt au pHi) ; 2D = IEF puis SDS-PAGE.